Des échantillons de tissus de momies sous les noms «Maria» et «Vavita» ont été envoyés du Pérou à un laboratoire russe pour la recherche. Les échantillons fournis de tissus biologiques ont été étudiés à l'aide de la microscopie électronique à balayage, des spectres Raman, de l'ICPE, la composition de la terre de diatomées (une substance à la surface de la peau des momies) a été étudiée. Une étude de l'ADN des tissus transférés a également été menée.
La préparation des échantillons
Des échantillons de tissu de 500 ug ont été transférés dans des tubes en plastique et dissous dans 1 ml de tampon (Tris-HCl 10 mM pH = 10,5, EDTA 1 mM, NaCl 0,15 M). Aux suspensions résultantes, du dodécylsulfate de Na a été ajouté à 0,5%, chauffé à + 80 ° C, et après 10 minutes, la protéinase K (jusqu'à 500 ug / ml) a été placée dans un thermostat (+55 ° C) pendant 24 heures.
La déprotéinisation a été réalisée par la méthode phénolique: ajout de phénol à volume égal à la suspension, puis phénol: chloroforme (1: 1), chloroforme; après chaque addition, une agitation constante a été effectuée sur un rotor angulaire et une centrifugation à 15 mille tours / minute, 10 min.
Au super-sédiment obtenu après la 3ème centrifugation, on a ajouté 1/10 partie du volume de NaCl 1 M et 2,5 volumes d'alcool éthylique deux fois distillé, et laissé une nuit à -30 C dans des tubes à essai coniques - "Eppendorf". La centrifugation a été réalisée à 15 000 vol. min. dans les 10 minutes et a reçu l'ADN "précipité" sous la forme d'un précipité brun. Le culot d'ADN a été lavé deux fois avec de l'alcool éthylique à 70% et séché à température ambiante (1 h) puis dissous dans du tampon TE.
La PCR a été réalisée sur un thermocycleur programmable "My Cycler" ("Bio = Rad") en utilisant des oligoprimères standards synthétisés par la méthode en phase solide à l'association "Beagler" (Saint-Pétersbourg). Le mélange réactionnel pour l'amplification avec un volume de 25 μL comprenait: 15 nM de chaque oligoprimère, 67 mM Tris-HCI pH = 8,8 à +25 C, 16,6 mM (NH4) SO4, 6,7 mM MgCl2, 6,7 μM EDTA, 10 mM 2 mercaptoéthanol, 170 μg / ml de BSA et un mélange de quatre dNTP basiques à une concentration de 1,0 mM chacun et d'ADN polymérase thermostable Thermus thermophilis (5 U / μl) (NPO SibEnzim). Après dénaturation (10 min, 94 C), 35 cycles d'amplification ont été réalisés pour chaque système d'essai: 94 ° C -1 min, 58 ° C - 1 min, 72 ° C - 1 min. Pour contrôler la spécificité, des échantillons d'ADN avec des génotypes connus pour les locus étudiés (systèmes de marqueurs), ainsi que des échantillons de contrôle, ont été introduits dans la réaction.contenant un mélange de réactifs sans ADN. Après amplification, un tampon de coloration a été ajouté à des aliquotes du mélange réactionnel (7 pi) et séparé par électrophorèse verticale dans un gel de polyacrylamide à 6% (210x150x1 mm), coloré avec du bromure d'éthidium et photographié sous lumière ultraviolette. Pour identifier les allèles, des standards alléliques correspondant à ces locus («ladders») ont été utilisés.
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Analyse ADN
Pour l'étude, nous avons utilisé la méthode d'analyse des exomes de l'ADN humain basée sur un séquençage à haut débit avec enrichissement par hybridation.
Technique d'analyse d'exome de l'ADN humain.
2 échantillons ont été analysés … Toutes les étapes de la préparation des échantillons avant la PCR ont été réalisées en salles blanches. La préparation des échantillons, l'extraction d'ADN et l'amplification de fragments d'ADN individuels ont été effectuées dans différentes salles.
Des adaptateurs spécifiques (KAPA Library Preparation Kit et SeqCap Adapter Kit; Roche) ont été ligaturés aux extrémités de l'ADN génomique fragmenté (~ 5 ng), après quoi une sélection en deux étapes de fragments dans la plage de longueur de 200-350 pb a été réalisée en utilisant des billes AMPureXP (Beckman Coulter) … Les fragments résultants ont été amplifiés avec des amorces spécifiques de l'adaptateur et hybridés avec des sondes spécifiques biotinylées (NimbleGen SeqCap EZ Choice MedExome; Roche) pendant 28 h à 47 ° C. Dans une réaction, deux échantillons d'ADN ont été combinés. Des hybrides sonde-ADN biotinylés ont été isolés et purifiés avec des particules magnétiques conjuguées à la streptovidine; une seconde amplification et une évaluation qualitative de la banque d'ADN résultante ont été réalisées (TapeStation 4200; Agilent Technologies). Afin d'éliminer les fragments d'amplification hors cible et les dimères d'adaptateur, la banque d'ADN a été re-purifiée en utilisant des particules magnétiques AMPureXP Beads (Fig. 1). La concentration finale de la bibliothèque préparée a été évaluée sur un instrument Quantus en utilisant un kit commercial QuantiFluor® dsDNA System (Promega). La banque d'ADN résultante a été immobilisée sur la surface de la Flow Cell. Le séquençage a été réalisé sur la plate-forme Illumina en utilisant une Flow Cell standard et un kit de réactifs MiSeq v2 300 (2 x 150 cycles). La banque d'ADN résultante a été immobilisée sur la surface de la Flow Cell. Le séquençage a été réalisé sur la plate-forme Illumina en utilisant une Flow Cell standard et un kit de réactifs MiSeq v2 300 (2 x 150 cycles). La banque d'ADN résultante a été immobilisée sur la surface de la Flow Cell. Le séquençage a été réalisé sur la plate-forme Illumina en utilisant une Flow Cell standard et un kit de réactifs MiSeq v2 300 (2 x 150 cycles).
Figure: 1
Évaluation générale de la qualité de l'ADN séquencé
Des méthodes standard telles que FastQC et les programmes Jellyfish et KraTER ont été utilisées pour l'évaluation initiale de la qualité. L'évaluation de la qualité n'a révélé aucun problème de qualité avec les lectures d'ADN séquencées pour les deux échantillons. Les images ne sont pas affichées car elles ne sont pas informatives.
Pour le premier échantillon (M supplémentaire, grande momie "Maria"), 113,4 millions de lectures ont été séquencées, pour le deuxième échantillon (plus de W, petite momie "WaWita"), 22,9 millions de lectures ont été séquencées.
L'étape suivante consistait à nettoyer les lectures séquencées de diverses séquences techniques susceptibles d'interférer avec une analyse plus approfondie. Pour cela, le programme Cookiecutter a été utilisé. Après le nettoyage, il y a eu respectivement 113,3 M (99%) lectures et 22,8 M (99%) lectures pour M et W.
Estimation de la quantité d'ADN ancien et de sa séparation du moderne
La méthode standard pour évaluer la présence et la quantité d'ADN ancien consiste à estimer la quantité de nucléotides endommagés par le temps. Pour cela, le programme MapDamage 2.0 a été utilisé. MapDamage 2.0 qui a montré la quantité d'ADN ancien à 30,1%, mais comme MapDamage implique que nous utilisons une référence proche, et nous ne savons pas exactement à quel point les deux échantillons sont proches du génome des humains modernes, et nous avons utilisé une bibliothèque d'exomes, cette méthode elle-même n'était pas suffisant. Une autre bonne méthode pour évaluer l'ADN ancien est le nombre de fragments courts.
La filtration du prétendu ADN ancien s'est déroulée en trois étapes. À la première étape, nous avons supprimé toutes les lectures appariées qui ne peuvent pas être croisées et assemblées en une lecture non appariée avec un chevauchement. Ces lectures ont indiqué que le fragment original qui a été séquencé était plus long que 300 pb. et très probablement l'ADN moderne. Ainsi, après cette étape, 86,9% et 91,8% sont restés, respectivement. Après cela, des fragments uniques se chevauchant ont été sélectionnés afin que leur longueur soit inférieure à 150 pb, car c'est la longueur que nous attendions pour l'ADN ancien. Après cette étape, il restait respectivement 8,6% et 38,5% pour les échantillons M et W. Il faut noter que malgré la différence de pourcentage, le nombre absolu de lectures entre les échantillons M et W est très similaire: 9,8M et 8,8M, ce qui peut s'expliquer par le fait que le contenu de l'ADN ancien dans les deux échantillons est similaire.
| Paramètre | Échantillon M (Maria) | Échantillon W (Wawita) |
| Nombre de lectures | 113,3 M | 22,8 millions |
| Pourcentage de fragments courts <300 pb | 86,9% | 91,8% |
|
Pourcentage de fragments courts <150 pb (nombre) |
8,6% (9 846 035) |
38,5% (8 813 220) |
|
Pourcentage de fragments alignés par génome humain (nombre) |
2,03% (2 345 084) |
9,65% (2 264 551) |
| Pourcentage de fragments alignés par génome humain à partir de courts <150 pb | 23,8% | 25,6% |
Obtention d'ADN similaire au génome humain de référence
L'ADN ancien putatif résultant a été mappé sur un génome humain de référence à l'aide d'un pipeline de recherche de variantes génomiques standard utilisant BWA, samtools et Wcftools.
De plus, seuls 23,8% de l'échantillon M et 25,6% ont été mappés avec succès sur le génome de référence des humains modernes. Dans le même temps, pour les deux échantillons, 75% des lectures séquencées n'ont pas pu être mappées sur le génome humain. Cela peut s'expliquer à la fois par la contamination et par le fait que ces échantillons sont situés suffisamment loin du génome des humains modernes. Dans le même temps, il convient de garder à l'esprit que nous avons séquencé la bibliothèque d'exomes et ainsi minimisé la contamination de l'ADN bactérien.
L'analyse de reconnaissance initiale des lectures non cuites a montré que certaines d'entre elles appartenaient à l'ADN répétitif spécifique des ongulés, cela peut s'expliquer par le fait que la graisse de lama était utilisée dans la momification.
Une analyse plus détaillée nécessite environ trois semaines de calculs, car les solutions existantes ne sont faites que pour les génomes viraux et bactériens, et nous devons comparer avec tous les génomes existants, y compris les génomes végétaux, afin de comprendre quelles espèces ont été séquencées.
Caractéristiques des options trouvées
Les lectures cartographiées ont été utilisées pour rechercher des variantes qui distinguent les échantillons M et W du génome humain moderne, ainsi que pour évaluer la contamination des lectures du chromosome Y humain.
La première question à laquelle il fallait répondre était de savoir sur quels chromosomes les lectures séquencées étaient mappées.
Puisque nous savons que les échantillons de Maria ont été isolés des os et des muscles, et ceux de Vavita uniquement des os, nous nous attendions à une différence dans la quantité d'ADNmt. Mais il n'y avait pas beaucoup de différence.
Le nombre de lectures cartographiées sur Y est un autre test de contamination par les humains modernes. Fait intéressant, il s'est avéré être le même dans les deux échantillons.
Les statistiques des variantes trouvées sont présentées ci-dessous:
| Paramètres | Échantillon M (Maria) | Échantillon W (Wawita) |
| Nombre d'options trouvées | 79957 | 48941 |
| Nombre d'options sur Y | 534 | 541 |
| Le nombre d'options fiables (plus de 20 lectures et plus de 30 qualité) | 16969 | 6181 |
| Variantes avec rsid connu (disponible dans la base de données snip) | 5701 | 3089 |
| Options générales valides | 92 | |
| options courantes avec rsid | 49 |
Après cela, il est devenu possible de répondre à la question: M et W sont-ils parents? La réponse est non.
Seulement 49 variantes correspondantes ont été trouvées entre M et W et 3040 différant pour les variantes avec rsid connu. De plus, il s'agit peut-être de différents types ou sous-espèces d'une personne ou d'une créature inconnue.
Fait intéressant, les variantes avec le chromosome Y sont identiques pour les deux échantillons, ce qui indique une contamination par la même personne, et que dans l'ancien ADN du chromosome Y, il n'y a probablement toujours pas de chromosome.
Évaluation de la similitude avec les génomes humains séquencés existants du 1000 Human Genome Project
Notez que ce n'est qu'une analyse approximative, car pour une analyse plus précise, des variantes sont nécessaires à partir de régions du génome sous sélection neutre, et nous avons des données d'exome.
Néanmoins, en utilisant 5708 variants pour M ou 3096 pour S, il a été possible de réaliser une variante de l'analyse par rapport aux données de 1000 génomes humains.
Le résultat de l'analyse PCA dans l'image ci-dessous est une superposition de deux images pour M et W, calculées séparément, car il y a trop peu d'options communes entre M et W pour estimer les distances entre M et W.
Score de similarité.
Comme vous pouvez le voir, il n'y a aucune coïncidence avec aucun groupe de gènes, ils diffèrent également les uns des autres. Mais il ne faut pas oublier que nous avons utilisé des séquences de codage sous sélection, et il est recommandé d'utiliser des variantes sous sélection neutre.
Néanmoins, le résultat de l'ACP est en bon accord avec la vérification manuelle des variantes, qui a montré que les données sont dans un homozygote non référencé, ce qui indique encore une fois que les images sont loin du génome humain moderne.
Conclusion
Malheureusement, nous étions limités à seulement deux échantillons, généralement dans ce type d'analyse plus sont utilisés, au moins 3-10 au moins en quelque sorte liés. Par conséquent, il est nécessaire de poursuivre les recherches avec un grand nombre d'échantillons.
Dans le même temps, nous pouvons très probablement conclure que les échantillons d'ADN de Mary et Vavita correspondent à l'ADN humain, mais ne coïncident pas avec l'ADN dont nous disposons à partir d'une base de données de 1000 personnes.
Auteurs du rapport: Baranov V. S. et Aseev M. V. (Institut de recherche scientifique en obstétrique et gynécologie, Département de diagnostic prénatal), Glotov A. S. et Glotov O. S. (Université d'État de Saint-Pétersbourg), A. S. Komissarov (Institut de cytologie, Académie russe des sciences, Centre de bioinformatique génétique).
Matériel fourni par Konstantin Georgievich Korotkov (docteur en sciences techniques, professeur, Université des technologies de l'information, de la mécanique et de l'optique) et Dmitry Vladislavovich Galetsky (candidat en sciences médicales, I. P. Pavlov First St. Petersburg State Medical University).
Pour en savoir plus sur les momies de Nazca, consultez le tag: momies de Nazca.
